上次我们简单讨论了一篇11分+的机制设计思路（点击阅读）：湘雅医学院-雷公藤甲素抗头颈部肿瘤焦亡机制登上医学顶刊(IF11+):线粒体己糖激酶-ΙΙ当时还有一篇9分+的文章没有谈到：
Cell子刊-年刊2k+:上中医揭示中药单?体路路通酸靶向TRAF2抑制结肠癌机制
今天补上，简单谈谈，这两篇文章的设计思路还是不同的：11分+用到了测序和靶点预测，这9分+则用药物亲和力反应性靶点的稳定性技术+液质联用表征；之前也有好友问如何将药效和机制结合起来，中间要用网络药理、代谢组学、转录组学、蛋白组学来预测吗。那么通过这两篇文章或许可以提供一些思路借鉴。
该文药理机制思路
1.考察路路通LDA抑制Wnt/β-catenin信号通路和结肠癌。首先为了在针对Wnt信号的天然产物筛选中可视化Wnt/β-catenin抑制，本文使用了含有TGC(TCF驱动GFP和SV40荧光染料)受体的EPT1细胞，因为TCF-GFP被GSK-3抑制剂6BIO强烈激活。在一个包含个天然产物的文库中，路路通酸(LDA)对6个bio激活的GFP表达表现出最强的选择性抑制作用。基于荧光素酶的TOPFlash报告基因也证实了LDA对Wnt/β-catenin信号通路的抑制。为了评估LDA对结肠癌中Wnt信号的抑制作用，我们将LDA应用于各种由于APC(SW)截断或突变的LDA(HCT和LST)导致Wnt/β-catenin信号异常激活的结肠癌细胞系。结果如下：2.为了进一步考察LDA抑制Wnt信号和结肠癌的潜在机制，首先确定LDA结合蛋白使用无标记策略称为“‘DARTS”（药物反应目标稳定性预测技术），并使用液相色谱质谱(LC-MS)分析表征LDA结合蛋白。TRAF2是最富集的蛋白，被认为是进一步研究的先前候选靶点。并进一步确定TRAF-c结构域上的-残基是TRAF2与LDA结合所必需的。这边特意给大家提供下DARTS和LC-MS筛选靶点的方法：3.深入考察TRAF2调控Wnt/β-catenin信号通路和结肠癌的作用：通过基因组DNA测序证实了TRAF2的基因敲除，通过Westernblot检测TRAF2杂合缺失和纯合缺失的HCT细胞克隆和增殖的情况，TRAF2敲除肿瘤的生长速度明显较慢，而在TRAF2纯合子敲除的癌细胞中，肿瘤的起始时间要晚得多。这些数据进一步支持了TRAF2是结肠癌治疗的潜在靶点。4.再进一步确定TRAF2是LDA抑制Wnt信号通路和结肠癌所必需的，且直接与β-catenin蛋白相互作用：在Wnt信号通路关键成分的coIP检测中，β-catenin被很容易在TRAF2免疫沉淀物中检测到。为了进一步确定β-catenin/TRAF2结合对N端磷酸化的需求，我们生成了一系列N端截断的β-catenin(图5G)。值得注意的是，coIP检测显示TRAF2与前32个残基有相互作用，但与β-catenin的磷酸化区域(b-cat-33-45)没有相互作用(图5G和5H)。b-cat-32和TRAF2的直接结合也通过MST实验得到证实，其结合亲和力接近全长b-连环蛋白(图5G）。综上所述，我们认为前32个残基对于β-catenin与TRAF2的结合是充分和不可或缺的，而磷酸化残基Ser45/Thr41/Ser37/Ser33参与其中，但不是相互作用所必需的。图4：图5：
5.LDA抑制结肠癌中TRAF2/β-catenin/TCF4/TNIK复合物的形成：最后，该文研究了LDA对TRAF2/β-catenin/TCF4/TNIK复合物的影响。与使用flag标记的β-catenin的coIP检测一致(图5E)，内源性β-catenin和TRAF2的相互作用很容易被检测到，并且在LDA处理后明显减弱(图7A和7B)。重要的是，在PLA和coIP检测中，b-连环蛋白和TCF4的相互作用也被LDA破坏(图7C和7D)，支持了TRAF2在b-连环蛋白/TCF4复合物形成中的重要作用。值得注意的是，在LDA的存在下，TRAF2和TCF4的相互作用没有改变(图7E)。此外，在平行实验中，LDA没有改变TNIK与复合物中其他组分包括TRAF2、β-catenin或TCF4的相互作用(图7F-7I)，表明TRAF2/β-catenin的相互作用而不是TNIK/b-连环蛋白的相互作用对β-catenin/TCF4复合物的形成至关重要(图7J)。
图6：
图7：
今天推文就到这了，水平有限，恳请批评指正。
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